La structure cristalline de la pneumolysine à une résolution de 2,0 Å révèle l'emballage moléculaire du pré

Scientific Reports volume 5, Numéro d'article : 13293 (2015) Citer cet article

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La pneumolysine est une cytolysine dépendante du cholestérol (CDC) et un facteur de virulence de Streptococcus pneumoniae. Il tue les cellules en formant des pores assemblés à partir d'anneaux oligomères dans des membranes contenant du cholestérol. Cryo-EM a révélé les structures des oligomères pré-pores et pores insérés liés à la surface de la membrane, mais les contacts moléculaires qui interviennent dans ces oligomères sont inconnus car les informations à haute résolution ne sont pas disponibles. Ici, nous avons déterminé la structure cristalline de la pneumolysine complète à une résolution de 1,98 Å. Dans la structure, les contacts cristallins démontrent les interactions probables qui permettent la polymérisation sur la membrane cellulaire et l'emballage moléculaire du complexe pré-pore. L'activité hémolytique est abrogée chez les mutants qui perturbent ces contacts intermoléculaires, soulignant leur importance lors de la formation des pores. Une structure cristalline supplémentaire du domaine de liaison membranaire suggère à elle seule que les changements dans la conformation d'une boucle riche en tryptophane à la base de la toxine favorisent les interactions monomère-monomère lors de la liaison membranaire en créant de nouveaux contacts. Notamment, les résidus à l’interface sont conservés chez d’autres membres de la famille CDC, suggérant un mécanisme commun pour l’assemblage des pores et des pré-pores.

La cytolysine dépendante du cholestérol (CDC), la pneumolysine1, est un facteur de virulence du pathogène humain Streptococcus pneumoniae (pneumocoque)2, principale cause de pneumonie bactérienne et agent majeur de méningite et de septicémie ainsi que de maladies débilitantes telles que l'otite moyenne, la pneumonie septique. arthrite, kératite et sinusite3. On le trouve dans pratiquement tous les isolats de pneumocoques et joue un rôle clé dans la colonisation bactérienne, l'invasion et l'inflammation4,5,6. Une caractéristique centrale de la toxine est la formation de pores transmembranaires dans les membranes contenant du cholestérol7, qui lysent ou perturbent le fonctionnement cellulaire, selon la concentration8,9,10. La pneumolysine et d'autres CDC se lient aux membranes des mammifères via une boucle riche en tryptophane et une paire thréonine-leucine au sein d'un domaine de liaison membranaire à la base de la toxine11,12. Il a été proposé que la boucle riche en tryptophane jaillisse du corps de la toxine lors de son association avec la membrane12. Les trois tryptophanes sont impliqués dans la liaison membranaire, mais Trp433 et Trp435 sont particulièrement importants13,14. Une fois liés à la membrane, les monomères s'oligomérisent ensuite pour former un complexe pré-pore qui subit ensuite un ensemble complexe de transitions structurelles pour former un pore transmembranaire, comprenant généralement 30 à 50 sous-unités. Les structures des oligomères pré-pores et des pores insérés ont été déterminées par cryo-EM à ~ 28 Å et ces structures, ainsi qu'une analyse récente du CDC associé, la suilysine, montrent que la formation des pores suit l'effondrement vertical du pré-pore. structure avec deux épingles à cheveux bêta étendues pénétrant dans la membrane pour former le grand pore du baril bêta7,15.

Bien que des structures radiographiques à haute résolution aient été déterminées pour plusieurs CDC, la pneumolysine s’est révélée insaisissable. Par conséquent, l’analyse structure-fonction s’est appuyée sur des modèles basés sur les structures des autres toxines CDC. Surtout, le manque de données à haute résolution signifie que les interactions permettant aux monomères de pneumolysine de se regrouper pour former les complexes de pores et de pré-pores ne sont pas connues. Dans ce travail, nous avons déterminé la structure de la pneumolysine à une résolution de 1,98 Å. La disposition côte à côte dans le cristal démontre l’empilement des monomères dans le complexe pré-pore. Des données structurelles et de mutagenèse supplémentaires ont identifié des résidus susceptibles de contribuer à l'oligomérisation lors de la formation pré-pores.

La pneumolysine complète et une forme tronquée comprenant le domaine de liaison membranaire (domaine 4) ont été produites par expression dans E. coli et purifiées par chromatographie d'affinité et de filtration sur gel. Des cristaux de toxine complète ont été cultivés à 4 ° C et à pH 8,5. Les meilleurs cristaux ont été obtenus à partir de protéines contenant les substitutions Asp385Asn et Cys432Ala. Aucune des deux mutations n’empêche la formation de pores16,17. L'unité asymétrique contenait une seule molécule présentant la structure caractéristique à quatre domaines d'un CDC, avec trois domaines non contigus (domaines 1 à 3) liés au domaine de liaison membranaire C-terminal (Fig. 1A) via le domaine en forme de sangle. 2. Les cristaux du domaine de liaison membranaire ont été développés à température ambiante et contenaient deux molécules dans l'unité asymétrique. Les deux modèles raffinés ont une bonne stéréochimie (Tableau 1) avec 95 % et 93 % de résidus dans les régions privilégiées de Ramachandran.