Caractérisation du métabolisme des lipides inositol dans l'intestin

Nature Microbiology volume 7, pages 986-1000 (2022)Citer cet article

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Les lipides inositol sont omniprésents chez les eucaryotes et jouent un rôle précis dans la signalisation cellulaire et l'homéostasie membranaire. Chez les bactéries, cependant, la production de lipides inositol est relativement rare. Récemment, il a été signalé que la principale bactérie intestinale humaine, Bacteroides thetaiotaomicron (BT), produisait des lipides d'inositol et des sphingolipides, mais les voies restent ambiguës et leur prévalence n'est pas claire. Ici, en utilisant des approches génomiques et biochimiques, nous avons étudié le groupe de gènes pour la synthèse des lipides d'inositol dans BT en utilisant une souche non décrite auparavant avec un contrôle inductible de la synthèse des sphingolipides. Nous avons caractérisé la voie de biosynthèse depuis la synthèse du myo-inositol-phosphate (MIP) jusqu'au phosphoinositol dihydrocéramide, déterminé la structure cristalline de l'enzyme BT MIP synthase recombinante et identifié la phosphatase responsable de la conversion du phosphatidylinositol phosphate d'origine bactérienne (PIP-DAG) en phosphatidylinositol (PI-DAG). In vitro, la perte de production de lipides inositol a modifié l'expression de la capsule BT et la résistance aux peptides antimicrobiens. In vivo, la perte de lipides inositol a diminué la condition physique bactérienne dans un modèle murin gnotobiotique. Nous avons identifié une deuxième voie putative, non décrite auparavant, pour la synthèse bactérienne de PI-DAG sans intermédiaire PIP-DAG, courante chez Prevotella. Nos résultats indiquent que la production de sphingolipides d'inositol est répandue chez les Bacteroidetes associés à l'hôte et a des implications pour la symbiose.

L'inositol, un sucre carbocyclique abondant chez les eucaryotes, constitue la base de divers phosphates d'inositol messagers secondaires phosphorylés et de lipides d'inositol. Dans leur forme la plus simple, les lipides inositol ont l'inositol comme groupe de tête polaire, par exemple le phosphatidylinositol (PI-DAG; squelette glycérophospholipidique; Fig. 1a) ou le phosphorylcéramide d'inositol (squelette sphingolipidique). Le groupe de tête inositol peut être modifié davantage, notamment par la phosphorylation du PI-DAG pour former des phosphoinositides bioactifs, ou par l'ajout d'un mannose aux sphingolipides de l'inositol pour former les phosphorylcéramides de mannosylinositol abondants dans la levure1,2. Les dérivés de l'inositol contrôlent les processus clés de la physiologie des cellules eucaryotes. Par exemple, bien que les phosphoinositides constituent une petite fraction de l’ensemble des phospholipides, ils sont essentiels au marquage de l’identité des organites, à la régulation des interactions cytosquelette-membrane et au contrôle de la division cellulaire et de l’autophagie3,4.

a, La voie métabolique de la synthèse des sphingolipides de novo en relation avec la synthèse des lipides de l'inositol, avec les enzymes BT étudiées dans cette étude (en gras noir) et des structures lipidiques représentatives, avec une longueur de chaîne et des ramifications reflétant les structures prédominantes déterminées par l'analyse des esters méthyliques d'acides gras (voir Supplémentaire Informations, figures supplémentaires 1 et 2 et tableau 6). Les schémas de ramification des lipides à base de dihydrocéramide sont prédits mais non confirmés. Les structures sphingolipides sont nommées en violet et représentées sur fond bleu clair ; Les structures glycérophospholipidiques sont nommées en vert sur fond gris. Les lipides d’inositol sont entourés d’un cadre en pointillés. SPT, sérine palmitoyltransférase. b, La région génomique de la synthèse de l'inositol BT et des lipides de l'inositol, avec numérotation chromosomique (représentée en orientation inverse). La couleur du gène (bleu ou rouge) indique l'appartenance à un opéron prédit par BioCyc. Les annotations concernent les fonctions enzymatiques élucidées dans cette étude (en raison de l'absence de phénotype lipidique dans sa souche knock-out, BT_1524 reste hypothétique). Les substrats et produits pour la partie sphingolipidique de a ne sont pas répertoriés, car ces réactions (au-delà du SPT) n'ont pas été caractérisées chez les Bacteroidetes.

Malgré la distribution répandue des lipides inositol chez les eucaryotes, on sait peu de choses sur la structure et la distribution des lipides inositol chez les bactéries. Les lipides bactériens d'inositol sont relativement rares et on pensait auparavant qu'ils se limitaient en grande partie à la synthèse de PI-DAG chez les actinobactéries (par exemple, les mycobactéries, les corynebactéries et les streptomyces)5,6,7 et les spirochètes (Treponema)8. Chez Mycobacterium tuberculosis, un agent pathogène intracellulaire obligatoire, les groupes de tête inositol du PI-DAG lient les facteurs de virulence des oligosaccharides de surface à la membrane externe9.

1.5 and exclude those with maximum absolute log2-fold-change difference in expression <1.5 in all pairwise comparisons of conditions. The tree above the expression data represents the Euclidean column clustering defining the sample order by expression similarity. Colour in the far right column indicates gene assignment to one of 8 CPS loci. Strains tested include WT BT, iSPT, ΔBT_1522 and iSPTΔBT_1526 in the iSPT background. SPT induction in the iSPT strains at 0, 0.2, 1.0, 5.0 or 100 ng ml−1 aTC induction is indicated in shades of grey. Labels below each column indicate strain, induction level and replicate ID according to the following pattern: ‘(strain) - (aTC induction in ng ml−1) (replicate A/B)’. Blue and pink shading emphasizes replicates from the ΔBT_1526 and ΔBT_1522 strains, respectively. b, Percent abundance of inositol among total glycosyl residues detected in each WT and inositol lipid knockout strain (n = 3 biological replicates per strain tested; means ± s.d.). Legend and data colours are the same as in c and d. Full capsule analysis (lipids and glycosyl residues) are available in Extended Data Fig. 6. c, IC50 (n = 2 biological replicates per strain) for each WT and BT inositol lipid knockout strain in minimal medium supplemented with the cationic antimicrobial peptide LL-37. Data are representative of two experiments and represented as mean ± s.d. One-way ANOVA F(5,6) = 35.5; P = 0.0002; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. WT vs ΔBT_1523 P = 0.0124; WT vs ΔBT_1525 P = 0.0007; WT vs ΔBT_1526 P = 0.0016. d, Caecal BT colonization of mice after 14 d bacterial association. Copies of BT (c.f.u.-equivalents quantified by qPCR analysis of BT_1521 copy number) present in mouse caecal contents after 14 d strain association. One-way ANOVA F(3,28) = 5.6; P = 0.004; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01 (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicate measurements). WT vs ΔBT_1526 P = 0.0496; ΔBT_1522 vs ΔBT_1523 P = 0.0480; ΔBT_1523 vs ΔBT_1526 P = 0.0050. Normality of data distribution was confirmed using the D’Agostino-Pearson test at alpha = 0.05. e, Percent abundances of WT in the combined WT + ΔBT_1523 population in the initial inoculum (n = 1, mean of 3 technical replicates) and in the caeca of 8 gnotobiotic mice following a 14 d colonization (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicates per mouse). The black line indicates the median of the WT BT abundance in mouse caeca following the competition experiment (73.0%)./p>100 glycosyl residues can be bound to a single lipid-linked inositol44,45. However, the low inositol abundance in our capsule analysis lacks enough statistical power to determine this unequivocally in BT. The CPS loci expressed by BT, and differentially expressed when MIPS is deficient, have been shown to influence recognition by the host adaptive immune system and bacteriophage29,46. The strong effect of MIPS deficiency on transcription of capsule-related genes may therefore indicate an indirect role for inositol on cross-kingdom interactions./p>20 mg l−1 of E. coli culture./p>1.5./p> 0.05. In the RNA-seq experiment, P values were calculated from empirical Bayes moderated t-statistics and adjusted according to the Benjamini-Hochberg method; only significantly differentially expressed genes with >1.5 absolute log2 fold change are reported. The ‘n’ reported in each experiment represents an individual biological replicate for the relevant experiment (for example, mouse caecal sample, bacterial culture). No statistical methods were used to pre-determine sample sizes, but our sample sizes are similar to those reported in previous publications51. Data collection and analysis were not performed blind to the conditions of the experiments. No animals or data were excluded from the analyses. In mouse experiments, mice were randomly assigned to a treatment condition to randomize age and litter of origin. For in vitro experiments, following strain generation, identical treatments were performed (for example, lipid extraction and analysis, capsule extraction and analysis, AMP resistance and growth curves) so randomized allocation was not necessary. TLC experiments were repeated independently at least two times with similar results./p>